糖萼层核心蛋白磷脂酰肌醇1通过保护内皮细

背景

随着年龄的增长及高血压的发生，动脉会失去弹性并变厚，进而发生动脉硬化。动脉硬化是年龄相关性心血管疾病如粥样硬化及中风的基础风险因素。内皮细胞功能障碍以组织增生、内皮通透性及炎症程度增强为特征，是这些年龄相关血管疾病发生的重要机制。这其中动脉硬化是促使内皮功能发生障碍的扳机点。

沿血管紧密排列的内皮细胞对机械力（剪切力及环周张力）高度敏感，并通过改变基因的表达及下游信号传导途径而适应机械力的变化。内皮细胞的表面覆盖着具有多向性功能的多聚糖也就是糖萼层。糖萼层中最常见的多聚糖类型是糖蛋白和蛋白多糖。硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）由核心蛋白（包括结合于浆膜的磷脂酰肌醇及跨膜的多配体聚糖）及与其共价结合的糖胺聚糖链所组成，糖胺聚糖链伸展到细胞外间隙并同血流紧密接触。

硫酸肝素、硫酸角质素和透明质酸是绝大多数细胞表面的主要糖胺聚糖成分。有关糖萼层结构的更多细节描述可见于最近的回顾性文章。

糖萼层在维持内皮细胞完整性及血管稳态方面起着关键性作用，主要机制是通过对内皮屏障功能的保护、对炎症及促炎细胞表达的抑制以及介导血流诱导的一氧化氮的释放。糖萼层是机械力传感器，能将血流剪切力转导至内皮细胞内，从而使其在基因层面及功能层面皆发生变化。

核心蛋白磷脂酰肌醇1在粥样硬化保护性以及单向剪切力所诱导的一氧化氮释放中起到关键作用，其中多配体聚糖4及多配体聚糖1曾被提示在粥样硬化保护性血流条件下具有控制细胞使其呈线性排列的作用。有趣的是，促粥样硬化因素以及较低的血管壁剪切力可加重糖萼层的丢失，导致内皮功能障碍及粥样硬化。除了粥样硬化，糖萼层丢失也会发生在其他疾病状态下如高血压、中风及糖尿病等。动脉硬化见于许多这类病变的病理结果中。动脉硬化促使内皮功能障碍，被认为既是疾病状态的起因又是其结局。

然而，动脉硬化是否影响糖萼层的表达？动脉硬化所介导的内皮功能障碍是否通过具有保护作用的内皮糖萼来调控？这两个问题的答案尚不明确。

此篇研究，作者通过实验证实了如下事实：1.内皮糖萼层的核心蛋白磷脂酰肌醇1可被程度加重的动脉硬化所抑制；2.无论体内还是体外实验皆证实，磷脂酰肌醇1对于动脉硬化所导致的内皮功能障碍具有保护作用。

研究方法

细胞培养：人脐静脉内皮细胞、小鼠脂肪垫内皮细胞，培养于37℃，CO2含量为5%的培养基；

聚丙烯酰胺凝胶：以底物僵硬度水平分别为2.5、5、10以及kPa下合成，或者以玻璃表面作为参照，分别模拟健康受试者内皮下层的僵硬度以及患有动脉疾病的僵硬度；

细胞种植在纤维连接蛋白覆盖的聚丙烯酰胺凝胶里，对照组的细胞种植于纤维连接蛋白覆盖的盖玻片上；

待细胞融合后（48小时），正式开展实验进程；

细胞功能评估：为评估磷脂酰肌醇1在动脉硬化所介导的细胞功能变化方面的作用，以siRNA作为基因沉默工具来抑制磷脂酰肌醇1的表达。以另外一种杂合的、非靶向的siRNA作为对照组。利用硫丙胺（Lipofectamine）在体外将siRNA转染至细胞内。利用一种磷脂酰肌醇1基因质粒（RC）来使磷脂酰肌醇1呈过表达，另外一种绿色荧光蛋白质粒（GFP）用来作为对照。转染24小时后，评估细胞功能：通过对单核细胞粘附进行检测来评估炎症状态，通过免疫染色和实时PCR检测来评估炎症分子的表达，同样通过免疫染色和实时PCR检测来评估抗炎症一氧化氮合酶的表达，以Ki67抗体来评估细胞扩增情况，通过测量上皮间充质标记物的表达评估上皮间充质转化的程度（EndMT）；

实时PCR法检测基因表达：细胞通过RLT裂解缓冲液进行裂解，以RneasyMinikit分离mRNA，然后以高通量cDNA反转录工具进行反转录；

对小鼠的处置：正规伦理审批程序，以吸入CO2进行安乐死处置。经手术提取下腔静脉、右心耳、主动脉。所有实验皆对下腔静脉予以免疫染色、成像及定量分析。为评估年龄相关动脉硬化对内皮细胞功能的影响，分别选用在第29-32周或6-8周的小鼠（GPC1-/-和GPC+/+野生型控制组）。每组实验至少采用5-10只小鼠；

统计分析：两组之间差异的比较应用Student’st检验；两组以上的比较应用ANOVA法(*p0.05,**p0.01,***p0.)。所有图均采用平均值±平均标准差标点绘制。

研究结果

底物的硬化可抑制糖萼层核心蛋白磷脂酰肌醇1及其硫酸肝素侧链；

底物的硬化可促进内皮细胞的炎症、增殖及上皮细胞间充质化；

底物硬化所促使的内皮细胞炎症、增殖及上皮细胞间充质化同磷脂酰肌醇1受抑制相关；

在体内实验中，年龄相关的血管硬化可抑制磷脂酰肌醇1并诱导内皮细胞炎症及增殖（图4）；

高龄介导的内皮功能障碍同磷脂酰肌醇1受抑制相关；

磷脂酰肌醇1在血管硬化所介导的内皮功能障碍中起保护血管内皮细胞的作用。

图1.底物的硬化可抑制糖萼层核心蛋白磷脂酰肌醇1及其硫酸肝素侧链。人脐静脉内皮细胞培养于聚丙烯酰胺凝胶，僵硬度分别为2.5kPa（软胶）及10kPa（硬胶），直至细胞融合（48小时）。

A：以免疫染色评估硫酸肝素（HS）（绿色）的表达，细胞核以DAPI（蓝色）来定位。评分栅：10um。

B：以荧光强度显示硫酸肝素的量化分析；

C：以百分位占比表示硫酸肝素的量化分析；

D：以实时PCR法测量编译核心蛋白的糖萼层基因、GAG合成及降解蛋白基因的表达；

E：以WesternBlot对评估磷脂酰肌醇1的蛋白表达，以对管家蛋白β-Actin为参照所计算的相对蛋白表达作为量化分析；

F：荧光染色（绿色），以DAPI（蓝色）来标记细胞核，通过测量荧光强度并标准化为百分比后，来评估细胞核的表达。

图2.底物硬化可呈浓度梯度地抑制磷脂酰肌醇1及其硫酸肝素侧链。细胞培养于聚丙烯酰胺凝胶，僵硬度分别为：2.5、5、10及kPa，以玻璃表面作为对照。

A：以免疫染色评估硫酸肝素（HS）（绿色）的表达，细胞核以DAPI（蓝色）来定位。评分栅：10um。

B：以百分位占比表示硫酸肝素的量化分析；

C：以荧光强度显示硫酸肝素的量化分析；

D：以实时PCR法评估磷脂酰肌醇1的表达；

E：以WesternBlot法评估磷脂酰肌醇1的蛋白表达，以对管家蛋白β-Actin为参照所计算的相对蛋白表达作为量化分析。

图3.硬化可通过提高炎症、增生、上皮间充质转化而促使内皮功能障碍。内皮细胞培养于聚丙烯酰胺凝胶，僵硬度分别为2.5kPa及10kPa凝胶，直至细胞融合（48小时）。

A：以单核细胞结合于内皮细胞表面的百分比评估炎症；

B：以实时PCR法评估炎症标记物基因表达，以HPRT作为管家基因；

C：为评估活性一氧化氮信号通路，磷酸化-eNOS的表达（绿色）及以DAPI（蓝色）确认细胞核，磷酸化-eNOS的表达以荧光强度来作为量化分析指标，并标准化为百分比；

D：以Ki67（红色）免疫染色法及将胞核用DAPI（蓝色）染色来评估细胞增殖的情况，箭头提示ki67阳性的胞核，数据量化为ki67阳性细胞所占的百分比；

E：以实时PCR法评估上皮间充质转化（EndMT）的基因标记物的表达。

以Student’st检验计算的*P0.05,**P0.01及***P0.

图4.磷脂酰肌醇1基因沉默对于在软胶（2.5kPa）上培养的细胞来说，可促使内皮细胞发生功能障碍。而对于在硬胶（10kPa）上培养的细胞则无作用。在软/硬胶上培养的细胞皆经siRNA处理以沉默磷脂酰肌醇1的基因表达，随后评估细胞功能：

A：以单核细胞结合于内皮细胞表面的百分比评估炎症；

B：以免疫染色评估磷酸化-eNOS（绿色）的表达，胞核以DAPI染色（蓝色）；

C：以实时PCR法评估炎症标记物的表达，以HPRT作为管家基因；

D：以Ki67（红色）免疫染色法及将胞核用DAPI（蓝色）染色来评估细胞增殖的情况，数据量化为ki67阳性细胞所占的百分比；

E：以实时PCR法评估上皮间充质转化（EndMT）的基因标记物的表达；

以Student’st检验计算的*P0.05,**P0.01及***P0.

图5.年龄介导的硬化抑制磷脂酰肌醇1并诱导内皮细胞发生功能障碍。为研究年龄相关硬化的作用，取来年轻小鼠（6-8周）及年老小鼠（28-32周）的降主动脉，并行免疫染色：

A：磷脂酰肌醇1（绿色，上排）、VCAM（红色）、Ki67（红色）及磷酸化-eNOS，胞核以DAPI定位，箭头指示ki67阳性的胞核；

B：磷脂酰肌醇1的荧光强度作为量化分析指标；

C：VCAM的荧光强度作为量化分析指标；

D：Ki67阳性的细胞百分比

图6.在小鼠动脉，动脉硬化通过对磷脂酰肌醇1的抑制而促使内皮细胞功能障碍。降主动脉分别提取自年轻小鼠（6-8周）或年老小鼠（28-32周），或为GPC1-/-或为GPC+/+野生型小鼠，免疫染色以评估：

A：磷酸化-内皮性一氧化氮合酶（eNOS）（绿色）；

B：VCAM（红色）；

C：Ki67（Ki67阳性细胞的百分比）；

D：Ki67阳性的细胞百分比

以荧光强度并以磷酸化-eNOS及VCAM1做百分比后作为标准化。以ANOVA检验法*P代表0.05,**P代表0.01

图7.磷脂酰肌醇1在血管硬化所介导的内皮细胞功能障碍中起保护血管内皮细胞的作用。培养于2.5kPa及10kPa的聚丙烯酰胺凝胶中的细胞，经基因质粒处理，以使其过表达磷脂酰肌醇1，相应地对照组细胞以非靶向GFP质粒处理，然后评估细胞功能：

A：以单核细胞结合于内皮细胞表面的百分比评估炎症；

B：以免疫染色评估磷酸化-eNOS（绿色）的表达，胞核以DAPI染色（蓝色）；

C：以实时PCR法评估炎症标记物的表达，以HPRT作为管家基因；

D：以Ki67（红色）免疫染色法及将胞核用DAPI（蓝色）染色来评估细胞增殖的情况，数据量化为ki67阳性细胞所占的百分比；

E：简化总结图显示年龄相关血管硬化通过抑制糖萼层核心蛋白磷脂酰肌醇1而促使内皮细胞功能障碍及血管疾病发生。

简化流程图显示：高龄/高血压可通过促使血管内皮下硬化，而抑制糖萼层核心蛋白磷脂酰肌醇1及与其相连接的葡胺聚糖等成分，从而导致内皮细胞功能障碍及血管疾病的发生。

结论

此项研究揭示：

血管硬化通过抑制磷脂酰肌醇1的表达而抑制了内皮糖萼层的机械力传导；

磷脂酰肌醇1在抑制内皮细胞功能障碍中起到保护作用；

磷脂酰肌醇1通过逆转僵硬度对内皮功能障碍的影响，从而具有潜在减缓血管疾病发展的作用，或许会成为引人注目的治疗新靶点。

文献解析

作者既往的多项体内及体外研究已提示：血管硬化可抑制磷脂酰肌醇1—内皮糖萼层的一种同硫酸肝素连接在一起所组成蛋白多糖中的核心蛋白，磷脂酰肌醇1的丢失同炎症、血管壁增生及内皮间充质转化相关，磷脂酰肌醇的过表达可逆转血管硬化效应。此项研究进一步揭示了动脉硬化至少部分地通过对磷脂酰肌醇1的抑制而促使内皮功能障碍及血管疾病的发生。此项研究还显示，底物水平的硬化可在内皮表面抑制磷脂酰肌醇1及糖萼层硫酸肝素的表达水平。既往的研究显示硫酸肝素和磷脂酰肌醇1在内皮表面呈相互关联性。有趣的是，在硬化的基质上培养的人脐静脉内皮细胞发现硫酸肝素的合成基因EXT2及EXTL2表达升高，提示存在一定的代偿机制。

既往研究曾提示，内皮糖萼层可被流体剪切力所改变，促粥样硬化性剪切力可抑制内皮糖萼层的表达并同粥样硬化病变的进展相互关联。内皮糖萼包括磷脂酰肌醇1的表达可被高血压所抑制。有趣的是，粥样硬化和高血压皆为老龄相关疾病，而动脉硬化在老龄相关疾病的发生及发展过程中扮演着重要角色。既往多项研究已证实，促粥样硬化因素及血管内膜表面的低剪切力可诱导动脉硬化发生，因暴露于管壁低剪切力而造成的内皮糖萼表达的抑制可能是由于血管硬化程度的增加或者硬化程度增加同低剪切力共同作用所致。此外，内皮糖萼（包括磷脂酰肌醇1）是可诱导NO产生的机械力感受器，此研究显示在硬化的凝胶上培养的血管及来源于年长小鼠动脉的内皮糖萼层皆呈显著减少。

既往研究已明确显示，动脉硬化的程度随年龄的增加而增加，年龄介导的血管硬化可间接地影响内皮糖萼的表达。内皮糖萼的表达（以内皮糖萼的厚度作为测量指标）在年长小鼠及年老的人体皆呈减低状态。本研究进一步阐明，血管硬化通过特异性地抑制糖萼核心蛋白磷脂酰肌醇1而抑制内皮糖萼的表达。磷脂酰肌醇是通过何种机制在硬化的底物上被抑制尚不明确，但其通过硬化的底物被抑制可能是通过一种miRNA的转录机制而达成。研究显示，磷脂酰肌醇1可作为人黑色素瘤miRNA-及内皮细胞的靶标。因此可能的机制是：内皮下硬化促进miRNA-的表达，反过来miRNA-再靶向作用于磷脂酰肌醇1的mRNA,从而导致磷脂酰肌醇在蛋白水平的减低。

另一项可能的机制涉及到机械感受整合素的信号转导。磷脂酰肌醇1位于脂阀及膜窖区，研究已显示促粥样硬化血流及底物硬化可导致膜窖不稳定并从细胞膜移除，因此提示对血管硬化的反应性的膜窖移除是磷脂酰肌醇1丢失的可能机制，本项研究通过ELISA方法试图评估磷脂酰肌醇是否可通过酶降解的方式被剥脱而进入培养基，结果提示磷脂酰肌醇1的水平不受底物硬化水平的影响，因此本研究数据提示上述所述剥脱机制的可能性小。

本研究观察到底物硬化可促使内皮功能障碍，这同既往多项研究结果相吻合。既往研究曾显示10kPa或更高的硬化水平可引发炎症水平、血管通透性、血管增生及内皮间充质化水平的加剧。既往研究也曾显示血管硬化可通过Nf-kB以及MAPK促炎信号通路途径而诱发细胞功能障碍，这些信号通路可通过诱导MCP1及ICAM1的表达并抑制抗炎症e-NOS信号途径而促使炎症发生。本研究提示，底物的硬化可通过p38介导的MAPK信号通路促使内皮功能障碍，硬化水平增强可促使p38磷酸化，而这种情况在软胶培养的磷脂酰肌醇1基因沉默的细胞中可观察到，这些数据提示磷脂酰肌醇1可能是通过抑制p38磷酸化而保护硬化介导的内皮功能障碍。这就同之前同炎症、增生及上皮间充质化所引起的硬化有关的各种信号通路如MAPK、RhoGTPase,NFkB,wnt/β-catenin以及YAP/TAZsignaling等相互关联并衔接起来。

本研究显示，底物水平硬化可诱发上皮间充质转化标记物如α-SMA及N-钙黏着蛋白的表达的增加，而对CD31的表达无作用。这些观察指标同既往研究结果相吻合，既往研究还显示低剪切力无论体内还是体外皆可部分诱导内皮细胞的上皮间充质转化，这种转变有一部分还与内皮功能障碍及疾病相关联。本研究中体内研究的数据旨在更广阔范围内研究年龄介导的硬化如何影响内皮功能障碍及血管疾病。此研究提供了一种过去未曾研究过的分子机制，即血管硬化通过抑制磷脂酰肌醇1的表达而促进内皮功能障碍的发生。

参考文献

MarwaMahmoud,MariyaMayer,LimaryM,etal.TheGlycocalyxcoreproteinGlypican1protectsvesselwallendothelialcellsfromstiffness-mediateddysfunctionanddisease.Cardiovasc.Res.Jul09;

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